・近年、がんの進化・不均一性・治療抵抗性の重要なメカニズムとして環状の染色体外DNA（extrachromosomal DNA, ecDNA）(※1)が注目されています。一方で、がん細胞内におけるecDNAの機能や動態については不明な点が多く、この理由の１つとしてecDNAを人工的に改変する技術が確立されていないことが挙げられます。
・CRISPR-Cas9 (※2)によるゲノム編集で用いるガイドRNAを最適化することにより（「セーフガードgRNA(※3)」を使用）、ecDNAの効率的なゲノム編集技術を世界で初めて確立しました。
・従来型のCRISPR-Cas9では、ecDNAの過剰なDNA切断が生じ、細胞死やecDNAの喪失が誘導されること、「セーフガードgRNA」を用いると、細胞毒性を抑えつつ効率的なゲノム編集が可能になることを体系的に明らかにしました。
・コンピューターシミュレーションを用いることにより、ecDNAにDNA切断が起きた時の細胞の応答を体系的に理解することに成功しました。
・今回確立したecDNAのゲノム編集技術は、がんの悪性化や薬剤耐性に深く関与するecDNAの機能解析・動態解明を可能にする基盤技術であり、将来的にはecDNAを標的とした新しいがん研究や治療戦略の発展に大きく貢献することが期待されます。
名古屋大学大学院医学系研究科分子腫瘍学の杉本陽平 大学院生、鈴木洋 教授らの研究グループは、がん細胞に多数存在する環状の染色体外DNA（extrachromosomal DNA, ecDNA）を対象に、CRISPR-Cas9を用いて効率的にゲノム編集できる技術の開発に成功しました。
近年、がんの進化・不均一性・治療抵抗性の重要なメカニズムとしてecDNAが注目されています。ecDNAは、がんの増殖を強く促す遺伝子などを含む特殊な環状DNAで、多くのがん細胞に存在し、１つの細胞内に数十コピーが存在することが知られています。細胞分裂のたびに不均等に分配されるため、結果としてその数が細胞ごとに不均一になります。このため、がんの悪性度が増し、がんが治療に抵抗性を獲得したり再発したりする原因になると考えられています。そのためecDNAの働きを調べることは、ecDNAを持つがんの本質を理解する上で欠かせません。
ecDNAの機能や挙動を詳しく理解するためには、CRISPR-Cas9などを用いてecDNAの配列を改変し、ecDNAの可視化や機能の解析などを実施することが重要です。しかし、がん細胞内におけるecDNAの機能や動態については不明な点が多く、この理由の１つとしてecDNAを人工的に改変する技術が確立されていないことが挙げられます。
本研究では、従来型のCRISPR-Cas9と、研究グループがこれまでに開発してきたCRISPR-Cas9の切断活性を任意に調節できるセーフガードgRNAを比較することにより、最適なecDNAのゲノム編集技術の開発に取り組みました。
興味深いことに、従来型のCRISPR-Cas9をecDNAに適用したところ、ecDNAが編集される効率が低いだけでなく、細胞死やecDNAの減少が顕著に生じることが明らかになりました。これらの現象は、１つの細胞内に多数存在するecDNAにDNA切断が過剰に生じることで、細胞に強いストレスが加わった結果である可能性が示唆されました。このため、多くの分野で広く使われている従来型のCRISPR-Cas9が、ecDNAのゲノム編集にはそもそも不向きであることが浮き彫りになりました。
この問題を解決するために、セーフガードgRNAを利用して切断活性を適度に抑えると、ecDNAの減少を回避しつつ、ecDNAに高効率でゲノム編集を行うことが可能になりました。さらに、実験結果とコンピューターシミュレーションを組み合わせた解析から、短い時間にecDNAのDNA切断がどれだけ集中するかが、細胞の生存やecDNAの維持、ecDNA編集の可否を左右する重要な要因であることを見出しました。
本研究の成果により、これまでゲノム編集が難しかったecDNAを効率よく編集することが可能になります。これにより、ecDNAがどのように振る舞い、がんの悪性化や治療抵抗性にどのように関与しているのかを、より詳しく調べることができるようになることが期待されます。
本研究成果は、2026年1月14日に国際学術誌『Nucleic Acids Research』のオンライン版に掲載されました。また、2026年1月27日付発行の印刷版に掲載予定です。
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(※1) 染色体外DNA（extrachromosomal DNA, ecDNA）：
10～60%のがん細胞で観察されることが報告されている、染色体とは独立して存在する環状のDNA。がんの増殖を強く促す遺伝子を含むことが多く、細胞分裂の際に均等に受け継がれないという特徴を持つ。この性質により、がん細胞集団内の不均一性が高まり、悪性化や治療抵抗性、再発に関与すると考えられている。
(※2) クリスパー・キャス9（CRISPR-Cas9）：
Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats / CRISPR Associated proteins 9の略。細菌の免疫機構を応用したゲノム編集技術で、ガイドRNA（gRNA）によって標的されたDNA配列をCas9という酵素が切断することで、遺伝子を編集することができる。
(※3) セーフガードgRNA ：
gRNAの構造を工夫することで、Cas9によるDNA切断の活性を調整できる技術。具体的にはgRNAの5ʼ末端にシトシン鎖を付加することで、付加したシトシン鎖の長さに依存してCas9活性を段階的に調整することができる。本研究ではこの仕組みを利用して、過剰なDNA切断を抑制し、ecDNAに対するゲノム編集を可能にした。研究グループは2023年にセーフガードgRNAを開発し発表している。
（参考）
・ Nature Biomedical Engineering, Optimization of Cas9 activity through the addition of cytosine extensions to single-guide RNAs. 2023 May;7(5):672-691. DOI:10.1038/s41551-023-01011-7.
・ プレスリリース：「ゲノム編集の効率や安全性を100倍以上高める新技術を開発」九州大学・名古屋大学、2023年4月11日
雑誌名：Nucleic Acids Research
論文タイトル：Optimized CRISPR-Cas9 system for efficient engineering of ecDNA in cancer cells
著者：Yohei Sugimoto1, Takeru Kachi1, Yu Watanabe1,2, Mei Kubokawa1,3, Koichi Ogami1, Masaki Kawamata4, Seiko Yoshino1, Hiroshi I. Suzuki1,5,6,7,
1 Division of Molecular Oncology, Center for Neurological Diseases and Cancer, Nagoya University Graduate School of Medicine, Nagoya, Japan
2 Department of Nephrology, Nagoya University Graduate School of Medicine, Nagoya, Japan
3 Department of Obstetrics and Gynecology, Nagoya University Graduate School of Medicine, Nagoya, Japan
4 Division of Organogenesis and Regeneration, Medical Institute of Bioregulation, Kyushu University, Fukuoka, Japan
5 Institute for Glyco-core Research (iGCORE), Nagoya University, Nagoya, Japan
6 Center for One Medicine Innovative Translational Research (COMIT), Nagoya University, Nagoya, Japan
7 Inamori Research Institute for Science (InaRIS), Kyoto, Japan
DOI: 10.1093/nar/gkag005
URL: https://doi.org/10.1093/nar/gkag005
English ver.
https://www.med.nagoya-u.ac.jp/medical_E/research/pdf/Nuc_260126en.pdf
